técnicas de ingeniería genética

 

  • Si tiene éxito, la técnica produce una planta adulta que contiene el transgén en cada célula.47 En los animales es necesario asegurarse de que el ADN insertado está presente
    en las células madre embrionarias.27 La descendencia puede ser examinada para detectar el gen. Todos los descendientes de la primera generación son heterocigotos para el gen insertado y deben cruzarse para producir un espécimen homocigoto.

  • Otras técnicas son la electroporación y la biolística.39 En algunos casos, las células transfectadas pueden integrar de forma estable el ADN externo en su propio genoma; este
    proceso se conoce como transfección estable.40 Para crear animales transgénicos, el ADN debe insertarse en embriones u óvulos viables.

  • Entre los cuatro tipos, TALEN y CRISPR/Cas son los dos más utilizados.62 Los últimos avances se han centrado en la combinación de varios sistemas para explotar las mejores
    características de ambos (por ejemplo, megaTAL, que es una fusión de un dominio de unión al ADN TALE y una meganucleasa).63 La investigación reciente también se ha centrado en el desarrollo de estrategias para eliminar o corregir genes sin
    crear roturas de doble cadena (editores de bases).62 Meganucleasas y nucleasas con dedos de zinc[editar] Las meganucleasas se utilizaron por primera vez en 1988 en células de mamíferos.64 Las meganucleasas son endodesoxirribonucleasas que
    funcionan como enzimas de restricción con sitios de reconocimiento largos, lo que las hace más específicas para su sitio diana que otras enzimas de restricción.

  • Un marcador seleccionable, que en la mayoría de los casos confiere resistencia a los antibióticos al organismo en el que se expresa, se utiliza para determinar qué células
    se transforman con el nuevo gen. Las construcciones se realizan mediante técnicas de ADN recombinante, como digestiones de restricción, ligaciones y clonación molecular.24 Insertar ADN en el genoma del huésped Una vez construido el gen, debe
    integrarse de forma estable en el genoma del organismo objetivo o existir como ADN extracromosómico.

  • Si la posición del gen puede determinarse mediante marcadores moleculares, una forma de aislar el fragmento de ADN correcto es realizar un recorrido cromosómico.

  • Transfección[editar] Artículo principal: Transfección La transformación tiene un significado diferente en relación con los animales, ya que indica la progresión a un estado
    canceroso, por lo que el proceso utilizado para insertar ADN extraño en células animales suele denominarse transfección.35 Hay muchas formas de introducir directamente ADN en células animales in vitro.

  • Aunque para crear organismos modelo transgénicos es aceptable un cierto grado de escisión fuera del objetivo, podrían no ser óptimos para todos los tratamientos de terapia
    génica en humanos.65 TALEN y CRISPR[editar] El acceso al código que rige el reconocimiento del ADN por parte de los efectores similares a activadores de la transcripción (TALE) en 2009 abrió el camino al desarrollo de una nueva clase de eficaces
    herramientas de edición génica basadas en TAL.

  • Aproximadamente el 1% de las bacterias son capaces por naturaleza de captar ADN extraño, pero esta capacidad puede inducirse en otras bacterias.26 El estrés de las bacterias
    con un choque térmico o la electroporación puede hacer que la membrana celular sea permeable al ADN que luego puede incorporarse al genoma o existir como ADN extracromosómico.

  • En el caso de los animales, el gen suele insertarse en células madre embrionarias, mientras que en las plantas puede insertarse en cualquier tejido que pueda cultivarse hasta
    convertirse en una planta completamente desarrollada.

  • Estos marcadores suelen estar presentes en el organismo transgénico, aunque se han desarrollado varias estrategias que pueden eliminar el marcador seleccionable de la planta
    transgénica madura.48 Confirmación[editar] Descubrir que un organismo recombinante contiene los genes insertados no suele ser suficiente para garantizar que se expresarán adecuadamente en los tejidos previstos.

  • De este modo, las ZFN tienen la capacidad de escindir el ADN en los sitios diana.53 Mediante la ingeniería del dominio de dedo de zinc para apuntar a un sitio específico dentro
    del genoma, es posible editar la secuencia genómica en el lugar deseado.

  • Los métodos basados en sustancias químicas utilizan compuestos naturales o sintéticos para formar partículas que facilitan la transferencia de genes a las células.36 Estos
    vectores sintéticos tienen la capacidad de unir ADN y dar cabida a grandes transferencias genéticas.37 Uno de los métodos más sencillos consiste en utilizar fosfato de calcio para unir el ADN y luego exponerlo a células cultivadas.

  • Otras modificaciones de estos sistemas permitieron a los investigadores inducir la recombinación sólo en determinadas condiciones, lo que permitió eliminar o expresar genes
    en los momentos o estadios de desarrollo deseados.52 La edición del genoma utiliza nucleasas artificiales que crean roturas específicas de doble cadena en los lugares deseados del genoma.

  • Es posible sintetizar genes artificialmente.22 Algunas secuencias sintéticas están disponibles en el mercado, lo que permite prescindir de muchos de estos primeros pasos.23
    Modificación[editar] El gen que se va a insertar debe combinarse con otros elementos genéticos para que funcione correctamente.

  • La región promotora inicia la transcripción del gen y puede utilizarse para controlar la localización y el nivel de expresión del gen, mientras que la región terminadora finaliza
    la transcripción.

  • La banda de ADN del tamaño correcto debe contener el gen, donde se puede eliminar del gel.18 : 40–41 Otra técnica para aislar genes de secuencias conocidas es la reacción
    en cadena de la polimerasa (PCR).21 La PCR es una potente herramienta que puede amplificar una secuencia determinada, que luego puede aislarse mediante electroforesis en gel.

  • Las únicas partes esenciales del ADN-T son sus dos pequeñas repeticiones de borde (25 pares de bases), al menos una de las cuales es necesaria para la transformación de la
    planta.3031 Los genes que se van a introducir en la planta se clonan en un vector de transformación de plantas que contiene la región de ADN-T del plásmido.

  • Una vez aislado un gen, puede almacenarse en el interior de la bacteria, lo que proporciona un suministro ilimitado para la investigación.11 Se pueden realizar cribas genéticas
    para determinar genes potenciales, seguidas de otras pruebas que identifiquen a los mejores candidatos.

  • Esta fase acuosa puede eliminarse y purificarse aún más si es necesario repitiendo los pasos de fenol-cloroformo.

  • Cruzando un organismo que contenga los sitios de recombinasa flanqueando el gen de interés con un organismo que exprese el RES bajo el control de promotores específicos de
    tejido, es posible eliminar o activar genes sólo en determinadas células.

  • Este enfoque consiste en atacar a un gen específico con una mutación y luego observar qué fenotipo se desarrolla.12 La mutación puede diseñarse para inactivar el gen o solo
    permitir que se active bajo ciertas condiciones.

  • Aunque las meganucleasas siguen siendo bastante susceptibles a la unión fuera del objetivo, lo que las hace menos atractivas que otras herramientas de edición de genes, su
    menor tamaño las hace atractivas sobre todo para las perspectivas de vectorización viral.

  • Si el gen expresa una homología cercana a un gen conocido de otra especie, entonces podría aislarse buscando genes en la biblioteca que coincidan estrechamente con el gen
    conocido.19 Para secuencias de ADN conocidas, pueden utilizarse enzimas de restricción que cortan el ADN a ambos lados del gen. A continuación, la electroforesis en gel clasifica los fragmentos en función de su longitud.20 Algunos geles pueden
    separar secuencias que difieren en un solo par de bases.

  • Los primeros métodos de inserción de genes en determinados lugares del genoma se basaban en la recombinación homóloga (RH).51 Al crear construcciones de ADN que contienen
    una plantilla que coincide con la secuencia del genoma objetivo, es posible que los procesos de RH dentro de la célula inserten la construcción en el lugar deseado.

  • Una vez aislados, se añaden elementos genéticos adicionales al gen para permitir su expresión en el organismo huésped y ayudar a la selección.

  • La manipulación genética dirigida por el hombre comenzó con la domesticación de plantas y animales mediante selección artificial en torno al año 12.000 a. C.1:1 Se desarrollaron
    varias técnicas para ayudar en la cría y la selección.

  • Este método puede utilizarse en plantas que no son susceptibles a la infección por Agrobacterium y también permite la transformación de los plástidos de las plantas.

  • Estas pruebas también pueden confirmar la localización cromosómica y el número de copias del gen insertado.49 Una vez confirmados, también se utilizan métodos que buscan y
    miden los productos génicos (ARN y proteínas) para evaluar la expresión génica, la transcripción, los patrones de procesamiento del ARN y la expresión y localización de los productos proteicos.

  • En este método, las células reciben una breve descarga con un campo eléctrico de 10-20 kV/cm, que se cree que crea agujeros en la membrana celular a través de los cuales puede
    entrar el ADN plasmídico.

  • Debido a la presencia de secuencias repetidas, son difíciles de construir mediante procedimientos estándar de biología molecular y dependen de métodos más complicados, como
    la clonación Golden Gate.62 En 2011, se desarrolló otra tecnología revolucionaria basada en los sistemas CRISPR/Cas (repetición palindrómica corta agrupada y regularmente interespaciada / proteína asociada CRISPR) que funcionan como un sistema
    inmunitario adaptativo en bacterias y arqueas.

  • Las células vegetales también pueden transformarse mediante electroporación, que utiliza una descarga eléctrica para hacer que la membrana celular sea permeable al ADN plasmídico.

  • La solución, junto con el ADN, es encapsulada por las células.38 Los liposomas y los polímeros pueden utilizarse como vectores para introducir el ADN en células animales cultivadas.

  • Se sugiere que la exposición de las células a cationes divalentes en condiciones de frío puede cambiar o debilitar la estructura de la superficie celular, haciéndola más permeable
    al ADN.

  • Muchas empresas venden ahora kits que simplifican el proceso.18 Aislamiento de genes[editar] El gen que los investigadores pretenden modificar (conocido como gen de interés)
    debe separarse del ADN extraído.

  • La ingeniería de las TALE mediante la fusión del núcleo de unión al ADN con el dominio catalítico de la nucleasa FokI permitió crear una nueva herramienta de nucleasas de
    diseño, la nucleasa TALE (TALEN).67 Tienen una de las mayores especificidades de todas las nucleasas de ingeniería actuales.

  • Más tarde se demostró que CRISPR/Cas9 puede editar células humanas en una placa.

  • Entre los avances más importantes figuran el descubrimiento de enzimas de restricción, ligasas de ADN y el desarrollo de secuenciación y reacción en cadena de la polimerasa.

  • Si existe un ADN donante que contenga la secuencia adecuada (homologías), el nuevo material genético que contenga el transgén se integrará en el lugar deseado con gran eficacia
    medianterecombinación homóloga.53 Hay cuatro familias de nucleasas diseñadas: meganucleasas, ZFN, nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN), las CRISPR/Cas (agrupadas regularmente interespaciadas cortas Repetición
    palindrómica/proteína asociada a CRISPR (p.

  • Mezclando con fenol y/o cloroformo, seguido de centrifugación, los ácidos nucleicos pueden separarse de estos restos en una fase acuosa superior.

  • Para determinar si un gen útil está presente en un fragmento concreto, se analiza la biblioteca de ADN en busca del fenotipo deseado.

  • Historia Muchos descubrimientos y avances diferentes condujeron al desarrollo de la ingeniería genética.

  • La creación de bebés resistentes al VIH por parte del investigador chino He Jiankui es quizá el ejemplo más famoso de alteración genética mediante este método.68 Es mucho
    menos eficaz en la corrección de genes.

  • El gen puede modificarse en esta fase para mejorar su expresión o eficacia.

  • En primer lugar, los ingenieros genéticos deben elegir qué gen desean insertar, modificar o eliminar.

  • Regeneración[editar] Como a menudo sólo se transforma una única célula con material genético, el organismo debe regenerarse a partir de esa única célula.

  • Para los organismos en los que la mutación no resulta práctica, los científicos buscan en su lugar individuos de la población que presenten la característica a través de mutaciones
    que se producen de forma natural.

  • La capacidad de diseñar organismos genéticamente se basa en años de investigación y descubrimientos sobre la función y manipulación de los genes.

  • El tipo de virus utilizado dependerá de las células objetivo y de si el ADN debe alterarse de forma permanente o temporal.

  • Tras descubrir la existencia y propiedades del ADN, hubo que desarrollar herramientas que permitieran manipularlo.

  • El ADN-T del plásmido se integra de forma semialeatoria en el genoma de la célula huésped.29 Modificando el plásmido para que exprese el gen de interés, los investigadores
    pueden insertar el gen elegido de forma estable en el genoma de la planta.

  • Aunque la primera generación carece de la especificidad de TALEN, la principal ventaja de esta tecnología es la simplicidad del diseño.

  • Más tarde, los genes pasaron a clonarse a partir de un segmento de ADN tras la creación de una biblioteca de ADN o sintetizarse artificialmente.

  • El ADN se puede visualizar tiñéndolo con bromuro de etidio y fotografiándolo bajo luz ultravioleta.

  • La recombinasa Cre es una enzima que elimina ADN mediante recombinación homóloga entre secuencias de unión conocidas como sitios Lox-P. El sistema Flip-FRT funciona de forma
    similar, con la recombinasa Flip reconociendo secuencias FRT.

  • Estas roturas están sujetas a procesos celulares de reparación del ADN que pueden aprovecharse para eliminar, corregir o insertar genes.

  • CRISPR/Cpf1 es un sistema descubierto más recientemente que requiere un ARN guía diferente para crear roturas particulares de doble cadena (deja salientes al escindir el ADN)
    en comparación con CRISPR/Cas9.

  • El experimento de Griffith ya había demostrado que algunas bacterias tenían la capacidad de captar y expresar ADN extraño de forma natural.

  • La reparación selectiva del ADN es posible proporcionando una plantilla de ADN donante que represente el cambio deseado y que (a veces) se utilice para la reparación de la
    rotura de doble cadena mediante recombinación homóloga.

  • También permite atacar varios sitios simultáneamente, lo que permite editar varios genes a la vez.

  • Una vez encontrados, los genes y otra información genética de una amplia gama de organismos pueden insertarse en bacterias para su almacenamiento y modificación, creando bacterias
    modificadas genéticamente en el proceso.

  • Existen varias técnicas para insertar el gen en el genoma del huésped y varían en función del tipo de organismo objetivo.

  • Los genes añadidos suelen ir acompañados de regiones promotoras y terminadoras, así como de un gen marcador seleccionable.

  • Para objetivos más complejos pueden estar implicadas vías biosintéticas enteras en las que intervienen múltiples genes.

  • Se puede colocar un marcador con fragmentos de longitudes conocidas junto al ADN para estimar el tamaño de cada banda.

  • Los liposomas cargados positivamente se unen al ADN,36 mientras que pueden diseñarse polímeros que interactúen con el ADN.

  • Inserción de genes dirigida Los métodos tradicionales de ingeniería genética suelen insertar el nuevo material genético de forma aleatoria en el genoma del huésped.

  • Otro método utilizado para transformar células vegetales es la biolística, en la que se recubren partículas de oro o tungsteno con ADN y se inyectan en células vegetales jóvenes
    o embriones de plantas.34 Parte del material genético entra en las células y las transforma.

  • Cultivando las células en presencia de un antibiótico o producto químico que seleccione o marque las células que expresan ese gen, es posible separar las células modificadas
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