mutagénesis (técnica de biología molecular)

 

  • En una ley de la Unión Europea (como la directiva 2001), este tipo de mutagénesis se puede utilizar para producir OMG, pero los productos están exentos de regulación: no hay
    etiquetado, no hay evaluación15 Mutagénesis dirigida al sitio Antes del desarrollo de las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio,16todas las mutaciones que se producían eran aleatorias, y los científicos tenían que recurrir a la selección
    del fenotipo deseado para encontrar la mutación deseada.

  • Este tipo de mutaciones pueden proporcionar información importante para la investigación del cáncer, como la comprensión de los mecanismos de desarrollo de la enfermedad.

  • El enfoque dirigido al sitio puede realizarse sistemáticamente en técnicas como la mutagénesis de barrido de alanina, en la que los residuos se mutan sistemáticamente a alanina
    con el fin de identificar residuos importantes para la estructura o la función de una proteína.23 Otro enfoque global es la mutagénesis de saturación de sitios, en la que un codón o un conjunto de codones pueden sustituirse por todos los aminoácidos
    posibles en las posiciones específicas.

  • Este método se puede usar para introducir una mutación o desactivar un gen, por ejemplo, como se usa en la producción de ratones knockout.31 CRISPR Desde 2013, el desarrollo
    de la tecnología CRISPR ha permitido la introducción eficiente de diferentes tipos de mutaciones en el genoma de una amplia variedad de organismos.

  • Con otras tecnologías, como la escisión del ADN en lugares específicos del cromosoma, la adición de nuevos nucleótidos y el intercambio de pares de bases, ahora es posible
    decidir dónde pueden ir las mutaciones.118 Diagrama simplificado de la técnica de mutagénesis dirigida al sitio utilizando oligonucleótidos prefabricados en una reacción de extensión del cebador con ADN polimerasa.

  • Mutagénesis combinatoria La mutagénesis combinatoria es una técnica de ingeniería de proteínas dirigida a un sitio mediante la cual se pueden diseñar simultáneamente múltiples
    mutantes de una proteína basándose en el análisis de los efectos de mutaciones individuales aditivas.26 Es un método útil para evaluar el efecto combinatorio de un gran número de mutaciones sobre la función de la proteína.27 Mediante el análisis
    combinatorio, se puede seleccionar un gran número de mutantes para una característica determinada.26 En esta técnica, se pueden modificar exhaustivamente múltiples posiciones o secuencias cortas a lo largo de una cadena de ADN para obtener
    una amplia biblioteca de proteínas mutantes.26 La tasa de incidencia de variantes beneficiosas puede mejorarse mediante distintos métodos de construcción de bibliotecas de mutagénesis.

  • También puede insertarse un segmento al azar en el gen para evaluar la importancia estructural o funcional de una parte concreta de una proteína.26 Mutagénesis por inserción
    La inserción de uno o más pares de bases, que da lugar a mutaciones del ADN, también se conoce como mutagénesis insercional.

  • Los retrovirus, como el virus del tumor mamario del ratón y el virus de la leucemia murina, pueden utilizarse para identificar genes implicados en la carcinogénesis y comprender
    las vías biológicas de cánceres específicos.30 Los transposones, segmentos cromosómicos que pueden sufrir transposición, pueden diseñarse y aplicarse a la mutagénesis insercional como instrumento para el descubrimiento de genes del cáncer.30
    Estos segmentos cromosómicos permiten aplicar la mutagénesis insercional a prácticamente cualquier tejido de elección, al tiempo que permiten una secuenciación del ADN más exhaustiva e imparcial.30 Los investigadores han descubierto cuatro
    mecanismos de mutagénesis insercional que pueden utilizarse en humanos.

  • Hermann Muller descubrió en 1927 que los rayos X pueden provocar mutaciones genéticas en las moscas de la fruta6 y utilizó los mutantes que creó para sus estudios de genética.7
    En el caso de Escherichia coli, los mutantes pueden seleccionarse primero mediante la exposición a la radiación ultravioleta y, a continuación, sembrarse en un medio de agar.

  • La mutagénesis no aleatoria puede utilizarse para clonar ADN, investigar los efectos de los mutágenos3 y diseñar proteínas.4 También tiene aplicaciones médicas, como ayudar
    a pacientes inmunodeprimidos, investigar y tratar enfermedades como el VIH y el cáncer, y curar enfermedades como la beta talasemia.5 Mutagénesis aleatoria Los primeros enfoques de la mutagénesis se basaban en métodos que producían mutaciones
    totalmente aleatorias.

  • Para solucionar este problema se introduce la secuencia genética correcta para los glóbulos rojos y se realiza una sustitución.5 Recombinación homóloga La recombinación homóloga
    se puede utilizar para producir una mutación específica en un organismo.

  • La versión de tipo salvaje de la proteína se muestra en la parte superior, con M representando el primer aminoácido metionina, y representando la terminación de la traducción.

  • Un enfoque de esta técnica consiste en extraer y sustituir una porción de la secuencia de ADN por una biblioteca de secuencias que contenga todas las combinaciones posibles
    en el lugar de mutación deseado.

  • Los avances metodológicos han hecho de la mutagénesis un proceso relativamente sencillo y eficaz.3 Constantemente se están desarrollando métodos más nuevos y eficaces de mutagénesis
    dirigida al sitio.

  • Este método permite la mutación puntual o la deleción o inserción de pequeños tramos de ADN en lugares específicos.

  • Estos métodos pueden implicar el uso de nucleótidos dopados en la síntesis de oligonucleótidos, o la realización de una reacción de PCR en condiciones que potencien la incorporación
    errónea de nucleótidos (PCR propensa a errores), por ejemplo reduciendo la fidelidad de la replicación o utilizando análogos de nucleótidos.8 Una variación de este método para integrar mutaciones no sesgadas en un gen es la mutagénesis por
    saturación de secuencia.9 Los productos de la PCR que contienen mutaciones se clonan en un vector de expresión y las proteínas mutantes producidas pueden caracterizarse.

  • También pueden producirse cepas mutantes que tengan una aplicación práctica o permitan investigar la base molecular de una función celular concreta.

  • La mutación dio lugar a un cambio en aminoácidos específicos y se analizaron los efectos de esta mutación.3 La mutagénesis de saturación es un tipo de mutagénesis dirigida.

  • Síntesis de genes A medida que cae el costo de la síntesis de oligonucleótidos de ADN, la síntesis artificial de un gen completo es ahora un método viable para introducir
    mutaciones en un gen. Este método permite una mutación extensa en múltiples sitios, incluido el rediseño completo del uso de codones de un gen para optimizarlo para un organismo en particular.34

  • Las técnicas actuales de mutación de sitios específicos tienen su origen en la técnica de extensión de cebadores desarrollada en 1978.

  • Pueden repetirse procedimientos similares con otros tipos de células y con diferentes medios de selección.

  • Por ejemplo, una técnica denominada “Seamless ligation cloning extract” (o SLiCE para abreviar) permite clonar determinadas secuencias de ADN dentro del genoma, y se puede
    insertar más de un fragmento de ADN en el genoma a la vez.2 La mutagénesis dirigida al sitio permite investigar el efecto de una mutación específica.

  • Esta imagen muestra la mutagénesis de saturación de una única posición en una proteína teórica de 10 residuos.

  • A continuación se muestran los 19 mutantes de la isoleucina en la posición 5.

  • Estas técnicas suelen implicar el uso de oligonucleótidos mutagénicos prefabricados en una reacción de extensión de cebadores con ADN polimerasa.

  • El método no requiere un sitio de inserción de transposones, no deja marcador y su eficiencia y simplicidad lo han convertido en el método preferido para la edición del genoma
    .

  • A continuación, las colonias formadas se replican, una en un medio rico y otra en un medio mínimo, y los mutantes que tienen requisitos nutricionales específicos pueden identificarse
    por su incapacidad para crecer en el medio mínimo.

 

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